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    MALDI 质谱成像技术因其独特的技术优势,包括实现多样的分子 类型,复杂样本上的分子空间分布等,已被多领域的研究引用

    MALDI 质谱成像技术因其独特的技术优势,包括实现多样的分子 类型,复杂样本上的分子空间分布等,已被多领域的研究引用

    近年来,在检测样本表面目标分子的空间分布上拥有强大能力的 MALDI (Matrix-assisted Laser Desorption Ionization) 质谱成像技术 (Imaging Mass Spectrometry, IMS) 越来越受关注。MALDI-IMS 已 被多种科研领域应用,并在多样性分子的可视化检测上不断突破,其中检测的分子种类已涵盖各种有机 小分子,化学药物,脂类,多肽及蛋白等 1,2。无需标记,在某些分子检测上甚至无需任何复杂的前处理, 就可以同步得到多个或多种类分子在复杂样本中,精确且高分辨率的空间表达,这些优势毋庸置疑地成 为了 MALDI-IMS 的标志。MALDI 质谱成像技术不仅提供精确的分子质量分布谱图信息,还能够在复杂 组织的结构上呈现微米级空间分辨率的分子表达特异性,这些结果一方面为分析和观察目标物的区域性 分布及组织在分子级别的结构性差异等方面带来新的见解和发现;另一方面,作为创新的成像技术,可 在临床领域辅助判断受损或病变组织区域的分子构成和变化机制,并潜在辅助寻找肿瘤标记物等;同时, 基于特异性分子的 MALDI 质谱成像,还可以精准协助个体化疾病诊断及用药和护理等方向的指导。 随着逐渐对质谱成像技术需求的提高,标准化的检测流程,包含样本前处理与仪器采集性能在内 的方法学优化成为了首当其冲的攻克目标。本应用介绍了一种高空间分辨率脂质质谱成像采集的操作流 程,该操作流程使用基质升华法对组织进行前处理,在 MALDI-TOF MS (QuanTOF) 上采集质谱数据。 MALDI-TOF MS (QuanTOF) Imaging 的成像采集满足 7S 指标 (Speed, Specificity, Spatial Resolution, Sensitivity, Stability, Simplicity & Size)3,4,为快速高效地达成高分辨、高灵敏的成像采集奠定了基础。通 过我们的前处理及采集方法,可以快速且高效地得到灵敏度,重现性和分辨率均良好,可信度较高的脂 类成像数据。通过 QuanIMAGE 质谱成像系统对数据的进一步处理和分析,可以得到清晰的多样性脂类 分子在组织内微米级别的结构分布成像,基于谱图的叠加与对比,成像的同源性分析等多种功能的应用, 为进一步分析目标脂质的区别性表达带来潜在的应用价值。

    实验

    ?样本前处理直接影响质谱成像数据的采集与分子成像的效果。本应用中,根据我们优化的组织前处理操作流程,经过多次实验 验证其稳定的高分辨谱图及成像结果,确认了其在脂质分子范围内成像应用的实用性

    A typical MSI workflow detailing steps from study design to reporting. (Figure modif ied from Swales etal., 20182 )

    【样本制备】

    MALDI质谱脂类成像的前处理主要分为三步:样本切片,基质升华和再水合。

    【样本切片】

    质谱成像推荐使用新鲜组织样本。新鲜解剖组织 (六周大鼠完整脑组织) 去除表面 明显的残余血迹后,立即放入液氮速冻 (或者异戊烷处理),5 min - 10 min 后将组织放 于-20℃ 恒定温度环境中 (冰箱/冷冻切片机),继续冷冻至少 1 小时。 准备就绪,使用OCT冷冻组织包埋剂 (Leica Microsystems, Wentzler, Germany) 固定组织,使用冷冻切片机 (CM1900/3050: Leica Microsystems, Wentzler, Germany) 进行组织样本切片,切片厚度控制在10 μm-12 μm。使用ITO导电玻璃 (Intelligene Biosystems, Qingdao, China) 贴附切好的样本切片,在低温的冷冻切片机内使用指腹 在切片背侧加热至完全融化贴合,以避免组织发生卷曲错位。

    【基质升华】

    样本切片在真空干燥器 (悦城) 中进行15分钟干燥后,固定于升华装置内 (ACE Glass) 进行升华处理: 基质:300 mg 1,5-DAN (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, U.S.A) 真空条件:4E-2 mbar 升华温度:145℃ 2 mins + 150℃ 4 mins (6-min-process)

    【再水合】

    升华后样本切片避光密封于切片盒/50 mL离心管内 (使用Parafilm进行密封),放 入-20℃冰箱2小时5 。再水合后样本在切片盒内可使用铝膜避光真空封装,4℃环境内 保存,三天内完成样本采集。

    【质量校准】

    Standard Kit:Bradykinin Fragment 1-7 & Angiotensin II, CHCA

    【样本检测】

    再水合后样本/从真空密封状态取出的样本可进行短时间的常温恢复及真空干燥, 样本放置于MALDI-TOF MS (QuanTOF) 成像载靶器上,通过控制器软件(QuanTOF Controller)操作载入仪器内。选择采集区域,设置采集方法后,提交采集任务进行自 动数据采集。采集完成后数据通过成像系统软件 (QuanTOF Viewer) 进行成像分析。

    【MALDI-TOF MS 条件】

    采集机型:QuanTOF

    采集模式:线性离子模式 (Linear Ion Mode)

    聚焦质量:950 m/z

    激光频率:5,000 Hz

    质量范围:100-1,500 m/z

    加速电压:10 kV

    检测电压:-0.8 kV

    激光能量:8 μL

    激光直径:10 μm

    空间分辨率:10 μm

    单谱图激光轰击次数:10 shots

    结果与讨论

    高空间分辨率的质谱成像结果普遍需要超长的采集时间,甚至需要把组织分割为多个 区域,先后加载到质谱仪中采集,以降低基质在真空下挥发/升华的影响(较大面积的组 织受到基质不均匀影响的主要表现包括阴阳面,成像不均匀等)。因此以成像采集的速 度与效率兼得为主的目标被视为主要的攻克难点之一6。升华法沉积基质后的效果请参考 图片1(Figure 1),基质附着均匀,组织轮廓清晰。使用QuanTOF MS进行成像采集,空 间分辨率为10 μm的完整大鼠鼠脑成像数据 (质量校准点数据除外) 共计120 GB,采集总时 长约4小时20分钟。总体质量出峰分辨率 (Resolution) 可达到同位素峰间分离 (Figure 2) ,低质量区域可达到基线分离。单谱图平均分辨率可达1.5K+,最高可达2K+。谱图上组 织内区别性表达的分子出峰信息丰富,质量精度可达到0.25 Da (250 ppm) 以内。从成像 结果上可见单分子在组织结构的区别性分布,成像完整,区域细节化清晰且空间分辨率 良好 (Figure 3 & 4)?;谥势壮上竦?s指标,2020年质谱成像专家Dr. Marvin Vestal 提 出的全新概念4,以标准化质谱成像的采集仪器的性能及特点。通过此次实验的验证,质 谱成像结果达到7s标准

    ?

    Figure 2: The spectrum with high resolution performed in IMS (Negative Ion Mode).

    A. Single spectra with 10 laser shots. B. The accumulated spectrum selected from the region of cerebellum.

    C. the cerebellum region selected for generation spectrum B.

    7s 指标

    Speed 速度

    速度指标由多个采集参数共同决定,主要包含高激光频 率(High Laser Rate = 5 kHz),激光扫描速度 (Motion of Sample Relative to Laser Beam = 5 mm/s),高离子化效率 (High Ionization Eff iciency ~ 50%),高速采集,处理&质谱数 据保存速率 (High Rate ~ 500 spectra/s)。速度的局限性也与 样本采集的质量范围,组织样本处理后的分子浓度与空间分 辨率直接相关。我们此次结果的采集基于QuanTOF MALDITOF MS Imaging 可达到的最高成像采集速度500 pixel/s (with 10 laser shots/pixel),平均采集速度 300 pixel/s。

    Specificity 质量精确度

    质量精确度与质量分辨率有关,受到仪器本身的功能性 与样本中分子的元素组成 (Elemental Formula) 局限。通过 校准品的外标法校准,我们可以得到同位素峰的质量偏差在 ±0.25 Da (250 ppm) 区间内的准确度。